BIOTIN快速标记试剂盒 产品说明书

 在您使用本产品前请认真阅读说明书，这对您顺利完成实验很有帮助。

产品货号：6213-50MG

产品名称：BIOTIN快速标记试剂盒

原理与应用：本试剂盒提供有预活化的生物素BIOTIN---NHS，适用于带有游离氨基的物质的标记，比如：带有游离氨基（伯胺）的抗体、蛋白或者化合物。本试剂盒采用特有稳定技术，活化的BIOTON稳定保存在液体中，吸取使用方便，同时试剂盒组成、配方和操作力求兼顾和优化，让您的标记工作变得简单且更易把控和操作！和其它试剂盒不同，本试剂盒还额外增加了标记后标记效果所有核心试剂与实验指导。

试剂盒组成：

操作步骤：

1. 从4℃取出BIOTIN快速标记试剂盒，恢复室温（一般15分钟左右）。

2. 首先要去除待标记抗体或蛋白中的含有氨基的缓冲成分物质，比如甘氨酸、Tris 等，可采用透析和超滤（透析袋和超滤管选择参考附件3）的办法置换缓冲液，以去除干扰物质达到好的标记效果！透析或超滤使用待标记物处理液进行（将待标记物处理液干粉充分溶解于纯水即可，每袋配1L无需调节PH。配好可存放于4℃，3-6个月内用完），超滤的话先加上蛋白同体积的标记物处理液再进行超滤，第2次后每次加2倍原蛋白体积的待标记物处理液，通常超滤4次即可（遇到溶解度较低的蛋白超滤时可能因为过于浓缩而产生聚集堵塞影响超滤，这一类蛋白建议透析），透析的话每次50X-100X体积，一共4次，每次不低于2小时，也可过夜（12小时），过夜时请尽量100X以上体积，透析请在4℃冰箱进行，另外注意使用搅拌透析可以按2小时一次节省时间。

3. 然后将抗体或蛋白的浓度调整到2mg-5mg/mL之间，其它浓度也行但是会影响标记体积，需要注意其对耗材以及缓冲液使用规格与量的影响。

4. 按照每取100ul抗体加标记启动液1.5ul后混匀，再按照每取1mg抗体或蛋白加活化BIOTIN 20ul,加完后迅速混匀开始进入标记过程，避光37℃ 2小时反应彻底。

5. 反应结束进行超滤或透析（透析袋和超滤管选择参考附件3），超滤或透析请使用与要保存的保存液一致的缓冲液进行，推荐使用0.01M PBS（PH:7.0，无需调PH的经验配方见附件2），一般超滤的话需要每次反应体积两倍的缓冲液，通常超滤6次即可（超滤溶解度较低的蛋白时一定要注意，可能由于离心浓缩造成部分聚集此时建议透析更科学），透析的话每次50X-100X 体积，一共4次，每次不低于2小时，也可过夜（12小时），过夜时请尽量100X以上体积，透析请在4℃冰箱进行，另外注意使用搅拌透析可以按2小时一次节省时间。

6. 透析结束可以加上防腐剂或保护蛋白（防腐剂推荐0.1%NAN3或者0.1%PROCLIN-300,蛋白一般选择BSA，如果后续实验加蛋白有风险请慎重）。如是超滤，超滤结束请用0.01M PBS（PH:7.0，无需调PH的经验配方见附件），按每毫克蛋白补足到0.5ml终体积即可，防腐剂添加量同透析。一切完毕后标记物建议-20℃保存，也可以短期4℃存放。

7. 标记后标记效果测试（请注意标记后不需要透析或超滤即可吸出部分标记物同时进行标记效果测试）：建议将标记物用0.01M CB,PH:9.6缓冲液进行包被微孔板，包被请采用倍比包被，12孔条首孔包被浓度2ug/ml（按投料的蛋白和体积计算浓度），第二孔1ug/ml以此类推每孔100ul，一共倍比包到12孔就好。37℃包被2-3小时或者4℃过夜都可以，包被结束用PBST洗一遍拍干（切记一定要洗一遍），然后加入HRP-SA工作液100ul/孔，37℃温育30分钟。温育结束PBST洗板5次并拍干，加TMB显色液100ul/孔，37℃温育显色20分钟，显色结束观察或打印（显色结束加50ul/孔 2M H2SO4终止，酶标仪单波长450nm读数或者双波长450nm/630nm与450nm/630nm读数）。不显色说明没有标记上，显色说明标记上但不同蛋白标记后效果有所不同,一般大多数蛋白在标记后按蛋白计包被浓度在16ng/ml时，也就是包被1.6ng/孔时（第8孔）,OD值在2.0左右（因各实验室ELISA条件和用液不同此结果仅供参考）。

注意事项：

1. 小分子药物不建议直接标记BIOTIN，BIOTIN标记后的作用及其有限，这种情况建议先偶联BSA以增加每个偶联物分子中小分子药物和BIOTIN的偶联量，这样效果会非常好。

2. 如果待标记物含有其它蛋白需要把无关蛋白同样计算进去，尽快如此也请您慎重选择这样的样品进行标记。

3. 本试剂盒保存4℃可以保证1年内开启有效，活化BIOTIN开启后小心取用切勿污染碱性物质和含氨基物质，虽然此试剂盒中它被保护的很稳定但为了避免意外发生也尽可能在有效期内的3个月内用完。

4. 注意透析袋为赠品数量不能支持无限次数的标记，仅支持大体积为20ML的蛋白的一次性标记，更多次更微量的标记实验请参考附件3使用实验室常规的合适的透析袋或者超滤管进行。

5. 本试剂盒是按蛋白50mg足量标记BIOTIN 2倍的量准备和使用的活化生物素，是为了涵盖客户各种情况也能尽可能的确保标记的成功率。也就是说使用中可以根据实际情况减少到说明书操作要求的1/2的BIOTIN用量(比如1MG生物素标记可以标记20MG的蛋白也能取得较为理想的结果），减少后可以标记更多的蛋白。标记试剂盒还可以支持标记量100ug的蛋白标记。

附件：

1. 0.01M  CB ，PH:9.6缓冲液配制：取NaHCO3, 0.67g和Na2CO3, 0.21g加水到1L溶解完全即可，不用调节PH。

2. 0.01M PBS,  PH:7.0缓冲液配制：取NaH2PO4·2H2O，0.49g和Na2HPO4·12H2O, 2.39g以及NaCL，9g加水1L溶解完全即可，不用再调节PH。

3. 超滤管和透析袋的截留分子量选择标准:首先要小于蛋白分子量，原则上可以小不能大。建议在蛋白分子量的1/8-1/2之间选择，比如蛋白分质量160K,选择20K-80K的截留量就好，根据经验使用较多的透析袋外部尺寸型号为：MD10和MD34，当然也可以使用其它尺寸。

特别提示：如果您在实验过程中遇到任何困难，请在及时联系我们技术团队获取支持。