HRP标记难，您选对试剂盒了吗？

一、引言

为了在WB/IHC/IF等免疫学实验中进行特异性蛋白的检测，需要在抗体或蛋白质上偶联上酶、荧光素、生物素、胶体金等追踪物，并借助于荧光显微镜、酶标检测仪或电子显微镜等精密仪器对试验结果进行测定，从而可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上进行定性和定位研究，也可应用于各种液相和固相免疫分析中。

免疫酶标记技术是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术，酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性。酶标记中，常用的就是辣根过氧化物酶（HRP），HRP能通过催化有过氧化氢参与的一系列氧化还原反应并释放信号，因此被广泛应用于免疫印迹(WB)，酶联免疫吸附 (ELISA)，以及免疫组织化学 (IHC) 等实验中。

辣根过氧化物酶HRP上的糖羟基可以被高碘酸钠活化生成醛基，这些醛基能通过Schiff碱与蛋白中的氨基偶联，紧接着还原Schiff碱形成稳定的偶联产物。虽然这种HRP标记方法已经被广泛认可和应用，但是也存在一定的缺陷，标记过程较为繁琐和耗时，而且标记后酶的活性容易丢失。洛阳佰盛生物技术有限公司提供了一种简单快速的HRP标记试剂盒。能够解决现有标记方法的这些缺陷。

图1：HRP快速标记试剂盒（洛阳佰盛生物）

二、标记原理与应用

高碘酸钠氧化法活化辣根过氧化物酶（HRP）的糖基，经过活化的HRP带有醛基可以与待标记物的游离氨基结合，发生希夫碱反应（Schiff's base reaction）。本试剂盒适用于带有游离氨基的物质的标记，比如：带有游离氨基（伯胺）的抗体、蛋白或者小分子化合物。

试剂盒内包括：预活化HRP、标记启动液、反应终止液干粉、标记物保存液、备用透析袋(MD6，截留量12KD）。

三、产品优势

（1）活性强：可以标记100μg的抗体或蛋白。

（2）标记效果好，标记率高，标记后酶与抗体（蛋白）的活性均无重大损失。

（3）稳定性高：HRP以冻干粉状态-20℃能保存数年，但在溶液中很不稳定且易失活（7天不失活），洛阳佰盛生物制备的试剂盒采用特有稳定技术，预活化的HRP在液体环境中4℃条件下可以保证1年内开启有效。克服了HRP在液体中的不稳定性。

（4）操作过程快捷、简单，活化后的HRP保存在液体中，吸取方便，无须柱纯化步骤。

（5）利用率高：与冻干形式的活化HRP相比，能够稳定保存在液体中的活化HRP减少了复溶过程及复溶后用不完废弃造成的浪费，可以用多少吸取多少，几乎不会产生损耗。

四、标记操作步骤

 （1）首先去除待标记抗体或蛋白中的叠氮钠、以及含有氨基的缓冲成分物质，比如甘氨酸、Tris 等，还有EDTA等物质，可采用透析和超滤的办法置换缓冲液，以去除干扰物质达到好的标记效果！透析或超滤缓冲液可选0.01M CB，PH:9.6缓冲液(0.01M CB，PH:9.6缓冲液配制：取NaHCO3，0.67g和Na2CO3，0.21g加水到1L溶解完全即可，不用调节PH），若实验室没有碳酸盐试剂再采用0.01M PBS（PH:7.0～7.4均可）透析或超滤置换缓冲液，然后调整抗体或蛋白的浓度到2mg/mL。如果抗体和蛋白不含上述这些干扰物质可以直接用上述PBS或CB缓冲液调整浓度到2mg/mL备用。

（2）从4℃取出HRP标记试剂盒，使各组分充分混匀。

（3）取500μL抗体或蛋白（约1mg），加入50μL预活化HRP(1mg)液体中，用移液枪反复吹打几次混匀，混匀后加入HRP标记启动液99μL（加入启动液量依据：

每10μL蛋白和HRP混合液加1.8μL启动液）继续混匀数次，避免产生气泡。然后避光30℃～37℃温箱偶联反应2～3小时，若遇快要下班也可放4℃反应24小时左右（此法效果一样或者更好不必担心）。

（4）偶联结束将反应终止液粉管中加入1mL去离子水混匀，取50μL加入3所述反应液中（加入终止液量依据：每1mg HRP加入终止液50μL），充分混匀，室温放置1 小时或者4℃ 2小时。

（5）终止完成后，可直接加入等体积的标记物保存液，充分混匀，置于-20℃保存。如果想更上长期的保存建议先用0.067M PBS  PH:7.0（0.067M PBS， PH:7.0缓冲液配制：取NaH2PO4.2H2O，5.35g和Na2HPO4.12H2O， 11.7g以及NaCL，9g加水1L溶解完全，添加NaOH，0.35g再次混匀后即可，不用再调节PH）透析或超滤置换缓冲液后再加标记物保存液。这样可以保存3年左右甚至更长。

图2：标记过程

五、标记注意事项

（1）待标记物缓冲液成分过于复杂以及含有氨基小分子和NAN3的初始缓冲液必须透析或超滤置换掉，请采用0.01M PBS（PH:7.0～7.4均可）或0.01M CB，PH:9.6缓冲液均可。

（2）如果待标记物不是抗体是其它蛋白，那么请根据分子量参考蛋白和酶用量：若分子量在40KD以上建议1mg蛋白使用1mg HRP；如果分子量在30KD左右，建议1mg蛋白使用1.3mg HRP；如果分子量在20KD左右，建议1mg蛋白使用2mg HRP；如果分子量在10KD左右，建议1mg蛋白使用4mg HRP；此时启动液和终止液请按步骤（3）和（4）描述标准适量加入；如果标记量为小于1mg的抗体或蛋白（可以0.1mg），HRP和其它试剂加入量按比例折算即可。

（3）小分子药物不建议直接标记HRP，因为HRP的结构不能结合足够的药物会造

成效价偏低，这种情况建议先偶联BSA增加小分子偶联量再进行HRP标记，这样效果会非常好。

（4）如果待标记物含有其它蛋白需要把无关蛋白同样计算进去，尽管如此也请您慎重选择这样的样品进行标记。

（5）本试剂盒保存4℃可以保证1年内开启有效，活化HRP开启后小心取用切勿污染碱性物质。

（6）终止液干粉一共5支，原则上每一支配好后仅限一次性使用，可以根据实验总量合理配制使用。

六、公司简介

洛阳佰盛生物技术有限公司位于十三朝古都、牡丹花城、中国历史文化名城洛阳市。主要从事生物诊断技术与材料的研发、技术服务与技术转让；相关技术与材料的应用范围涵盖食品安全检测、动物疾病诊断、人类疾病诊断、抗体制备、细胞培养及生命科学仪器等。客户主要包括大学(食品科学院系、生物技术院系、医学院系)、科研机构、食品安全诊断试剂公司、动物疾病诊断试剂公司、人类疾病诊断试剂公司。做好基础研发，助力祖国科研是我们的主要目标。目前公司拥有或授权使用的商标有BIOABLAB\ABLAB。产品订购电话：0379-60665856，18903798022。